GF594一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)
高灵敏度捕捉早期新号 细胞、切片全兼容
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Instruction manual- Product Description
- Composition
- Precautions
-
产品保存：
低温运输，-20˚C储存。荧光试剂须避光保存。一年有效。
产品简介：
GF594一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡过程中基因组DNA的断裂情况 , 其原理是荧光染料标记的dUTP(594-dUTP)在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的催化下连接到断裂DNA的3’-OH末端，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。本试剂盒适用于组织样本(石蜡切片和冰冻切片)和细胞样本(贴壁细胞和悬浮细胞)的凋亡情况检测。
使用说明
细胞固定及通透
1. 对于悬浮细胞或细胞悬液：
a. 收集细胞1-2*106 个细胞，用PBS洗涤一次。
b. 用4%多聚甲醛室温固定10-15分钟。
c. 用PBS洗涤1-2次。
d. 用0.5mL透膜液(0.5% Triton X-100 in PBS）重悬细胞，室温孵育5分钟。
e. 用PBS洗涤2次。
2. 对于贴壁细胞(48/96孔板)或细胞涂片：
a. 用PBS洗涤1次。
b. 用4%多聚甲醛室温固定10-15分钟。
c. 用PBS洗涤1-2次。
d. 每孔加0.1-0.2mL透膜液(0.5% Triton X-100 in PBS），室温孵育5分钟。
e ．用PBS洗涤2次。
3. 对于石蜡切片：
a. 二甲苯脱蜡10-15分钟，新二甲苯脱蜡10-15分钟。无水乙醇5分钟，90%乙醇2分钟，80%乙醇2分钟，70%乙醇2分钟，之后放于PBS中洗涤3次，每次5 分钟。
b. 擦干组织周围的液体，组化笔在组织周围画圈，圈中加适量20μg/mL的蛋白酶K(不含DNA酶) , 室温孵育15-30分钟。
c. 用PBS洗3次。注：蛋白酶K需洗涤干净，以免影响后续反应。
4. 对于冰冻切片：
a. 用4%多聚甲醛室温固定30-40分钟。
b. 用PBS 洗涤2次，每次5分钟。
c. 加入透膜液(0.5% Triton X-100 in PBS），室温孵育5分钟。
d. 用PBS洗涤2次。
阳性对照样品处理（可选）
1. 将10x DNase I Buffer至1x ( 9份去离子水+1份10x DNase I Buffer) 。将50μL 1x DNase I Buffer 滴加至组织或细胞，室温平衡5分钟。
2. 参照下表配制DNase I反应液：
1个样品 10 × DNase I Buffer 5μl DNase I 2.5μL ddH2O 42.5μL 总体积 50μL 3. 去除1x DNase I Buffer ，将DNase I反应液加入组织或细胞，37℃孵育30分钟(48孔板可放置摇床，转速200转每分钟；96孔板可不放摇床)。
4. 用PBS洗涤2-3次。
TUNEL检测
参考下表配制适量TUNEL检测液，需充分混匀，现用现配。
1个样品 TdT Enzyme 1μL 5 × Equilibration Buffer 10μL 594-dUTP 5μL ddH2O 34μL 总体积 50μL 1. 对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片：
a. 去除PBS ，每个样品加50μl TUNEL检测液，37ºC避光孵育60分钟 (48孔板可放置摇床，转速200转每分钟) 。注：根据样品面积适当增加TUNEL检测液的用量。组织切片或细胞涂片可在滴加TUNEL检测液后覆盖塑料片以防蒸发。
b. 用PBS洗涤2次。
c. 染核(可选) ，用PBS以1：500稀释Hoechst33342配制足量染色液，室温避光染色5-10分钟。
d. 用PBS洗涤2次。
e. 封片，荧光显微镜下观察。594-dUTP激发光/发射光为585/609nm 。Hoechst33342激发光/发射光为346/460nm。
2. 对于悬浮细胞或细胞悬液：
a. 去除PBS ，每个样品加50μL TUNEL检测液，涡旋混匀，37ºC避光孵育60分钟，期间可每隔15分钟涡旋一次。
b. 用PBS洗涤2次。
c. 染核(可选) ，用PBS以1：500稀释Hoechst33342配制足量染色液，室温避光染色5-10分钟。
d. 用PBS洗涤2次。
e. 用300-500μL PBS悬浮细胞。
f. 用流式细胞仪检测或在荧光显微镜下观察。
自备试剂
10mM PBS ，pH7.2-7.6
4%多聚甲醛溶液(4%PFA)
透膜液(0.5% Triton X-100 in PBS）
蛋白酶K溶液(20μg/mL)(组织切片检测用)
组织切片脱水所用试剂(二甲苯、梯度酒精）
流式细胞分析管
48/96孔细胞培养板
免疫组化笔
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产品组成
货号/规格 组分名称
DNase I
10 × DNase I Buffer
体积25μL
50μL
100-133-20/50 (20T/50T) TdT Enzyme
5 × Equilibration Buffer 594-dUTP
Hoechst33342
20/50μL
200/500μL
100/250μL
20/50μL
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注意事项
1. 试剂请置于冰上融化，开盖前需瞬时离心，使用完及时放回-20˚C保存。
2. 实验可设置阳性对照组，每批实验设置一个阳性对照，阳性对照细胞用DNase I处理，本试剂盒包含10次的阳性对照试剂量。
3. 每次实验建议设置阴性对照组，阴性对照组不加TdT Enzyme。
4. 酶制剂较粘稠，取样体积小，需注意移液器取样操作规范。
5. 本试剂盒仅用于科学研究，不用于临床诊断。
Keywords
GOONIE
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