本篇文章来源于微信公众号:信天翁GOONIE

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在qPCR实验前清除RNA中的gDNA，主要是为了确保qPCR检测到的信号完全来自于目标RNA（cDNA），而不是被残留的gDNA所污染，从而保证定量结果的准确性和可靠性。 逆转录原理图 qPCR原理图 qPCR如果不去gDNA会检测到什么？ qPCR的目标：定量检测特定的cDNA序列，该cDNA是由我们感兴趣的mRNA通过逆转录而来的。 但是基因组DNA（gDNA）也包含我们所检测基因的序列。 如果RNA样品中混有gDNA： qPCR的引物无法区分它们是要结合到cDNA上还是gDNA上。 引物会同时与cDNA和gDNA结合并进行扩增。 这样，最终检测到的荧光信号就是 “cDNA信号 + gDNA信号”的总和。 gDNA污染会直接导致定量结果出现严重偏差定量值假性偏高： 这是最直接的影响。检测的基因表达量会比实际值高，因为一部分信号来自于“背景噪音”gDNA。 数据失真，无法反映真实生物学差异： 假设你比较实验组和对照组的某个基因表达量。如果两个样品的gDNA污染程度不同（这在处理样品时很常见），那么你观察到的表达差异可能根...

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在分子生物学实验中，当研究人员历经艰辛从细胞中提取出珍贵的RNA后，所做的第一个关键步骤往往就是：将其溶解在DEPC水中。 此外，配制电泳缓冲液、稀释试剂乃至清洗实验器皿，都离不开它。 DEPC水可以为脆弱的RNA分子创造一个安全的环境，彻底清除无处不在的“RNA杀手”——RNase。 那么，DEPC水是如何抑制RNase的呢？ 什么是DEPC水DEPC是什么？ 它的中文全名是焦碳酸二乙酯，是一种非常活跃的有机化合物。在常温下，它呈无色液体状。 那么我们要如何制备呢？ 研究发现0.1%的DEPC即可起到抑制RNase的作用。 将0.1%（v/v）的DEPC加入水中。即比如在水中加入1mL的DEPC制备成1000mL的DEPC水，就可以制备DEPC水。 DEPC呈有机物状态，加入水中以后，无法与水马上相溶，需要充分混合。 通常可以用电动搅拌仪和搅拌子在室温搅拌数小时或过夜，让DEPC与水相溶，与潜在RNase充分反应。 最后，有一个至关重要的步骤：必须通过高温高压灭菌处理，以去除水中未反应的DEPC。因为DEPC本身也会破坏后续...

简单来说，动物组织的标准流程之所以能“先加裂解液后研磨”，是因为动物组织比植物组织“友好”得多。 植物细胞有坚硬的细胞壁植物细胞有坚固的纤维素细胞壁，物理上非常坚韧，需要极强的机械力（如液氮冷冻脆化后研磨）才能有效破碎。 动物细胞只有柔韧的细胞膜，没有细胞壁。在裂解液（通常含有去污剂如SDS）中，细胞膜会迅速被溶解。因此，对于小块动物组织，仅靠涡旋、匀浆器或珠磨的轻微机械力就足以完成破碎。 RNase含量和分布的差异植物组织：RNase不仅含量高，而且常储存在独立的区室中，如液泡、细胞壁。一旦机械破碎不彻底，这些区室破裂会持续释放RNase，而裂解液渗透需要时间，这就造成了RNA降解的“时间窗口”。 动物组织：而常用的实验组织（如肝、脑、肌肉等）本身的RNase活性相对较低。动物细胞的RNase没有储存在类似植物液泡那样坚固的区室里。当裂解液接触到组织时，它能更快、更均匀地渗透并失活所有RNase。 植物组织先液氮冷冻研磨，后加裂解液，主要是为了在裂解细胞、释放RNA之前，最大限度地抑制RNA酶（RNase）的活...